妄学植物

· 用六偏酸磷钠 or  焦磷酸钠处理样品。

         -硅藻可能会残留在上清液中，检查上清液中的硅藻。

         -会导致硅藻的溶解。尝试处理重复样本，增加处理时间直至溶解明显，然后将处理时间减半。

· 对在蒸馏水或双氧水处理中的样品进行温和的超声波（可能使长硅藻破碎）。尝试增加处理时间以检查破碎的效果。

· 用大量液体处理小量样品（首先在水中重复重悬浮以去除粘土，6-8小时沉淀时间。）

· 用重液分离去除粘土。

· 用扫描电子显微镜检查是什么与硅藻粘合在一起。

· 在制备过程中不要是硅藻处于太少液体中。

· 如果样品中有机质含量高，则增加过氧化氢的用量。

Reference: Bates, CD, Coxon, P, Gibbard, PL. 1978. A new method for the preparation of clay-rich sediment samples for palynological investigations. New Phytologist 81: 459-463.

与构成沉积物的土壤颗粒数目相比，硅石经常是以非常少量的数目出现，以至于当在镜下观察土壤颗粒的时候，植硅石的存在不是那么一目了然。因此，植硅石必须从土壤中分离出来并得到集中。这一工作大部分是用化学悬浮来完成的。首先，我将把我认为是最有效并且可靠的方法详细地解释一下，并对可能要用到的各种替代试剂做些讨论；然后，简述这种方法的几种替换法；最后，讨论植硅石分类过程中将产生特殊问题的几种土壤类型。

在化学悬浮以前，必须采取一些步骤来促使植硅石从土壤块体中分散开来，并且除掉不需要的物质，如碳酸盐和有机物，从而使得植硅石自由悬浮于重液溶液中。第一步是土壤样品的松散，即把25-30g 土壤样品溶于六聚偏磷酸钠(Calgon)或碳酸氢钠溶液中，反复搅拌。也可采用六偏磷酸钠(sodium hexametaphosphate，与Calgon类似)。若使用自动振荡器，则可达到隔夜松散的目的；根据土壤的疏松程度，也可通过手工方法在几天内达到松散的的目的。这一步骤对于多数沉积物类型来说是必要的，因为植硅石总是以一定的方式粘附于土壤颗粒中，只有非常小的一部分游离于土壤间隙中。同样的情况也适用于花粉粒。

第二步是分离砂粒，即颗粒直径大于50μm的土壤部分。这可通过采用270目筛的湿筛法而轻易达到目的。砂级部分搁在一边作为以后分析用，因为这部分土壤含有许多多细胞的植硅石块以及一些属种的植硅石，如Cucurbita（南瓜属）。粘土（即直径小于5μm的土壤颗粒）也应除掉。我发现这一步骤是必要的，因为轻的粘土颗粒，如果达到一定的量，将浮于重液溶液中，导致植硅石被土壤污染。可采用几种方法来除掉粘土，但是，最有效的方法似乎是重力沉积法，即采用Jackson（1956）发表的方法和沉积速率。

把土壤样品置于大的烧杯中加水至10cm高度，充分搅拌溶液，一小时后，小心地倒掉上部清液，余下的就是粉砂级部分（5-50μm）。重复这一步骤7-8次可以除掉土壤中的大部分粘土。除掉小于5μm大小的颗粒可能会产生问题，因为 一些植物产生的可鉴定植硅石就在这个大小范围内，包括Canna（美人蕉属）和Bromeliads（凤梨），它们已从土壤中分离出来。因此，看来有一些植硅石确实在去除粘土的步骤中被漏掉，但是，相对于它们在土壤中的实际丰度来说，可能只是较小的一部分。当经过一定时间后，上部液体呈现清晰透明时，则去除粘土的工作已经完成。

下一步，粉砂级部分可以进一步分馏成细粉砂级（5-20μm）和粗粉砂级（20-50μm）。许多研究者并不采用这一步骤，因为它耗费时间，并且使要提取的样品数目加倍。然而，我发现这样做是值得的，而且常常甚至是必要的，因为在分析不分馏的粉砂时，植硅石组合中充满许多大的植硅石，而小的植硅石（如禾本科的短细胞、棕榈树以及其他特征的小型体）难于发现，并且不易于定量；当你为评价玉米而对发现大量十字形植硅石感兴趣的时候，在细粉砂中集中5-20μm的植硅石尤其显得重要。另外，我还发现，当粉砂级部分被细分后，能够得到更多的植硅石。

粉砂的分馏还可以用重力沉积法达到。样品置于100ml的长形烧杯中，加水至5cm高度，搅拌，然后静置3分钟；把含有细粉砂的上部液体倒入一个1000ml的烧杯中，余下的悬浮液再次加水稀释至5cm高度，搅拌，静置2分20秒，然后把上部液体倒入上述的1000ml烧杯中。重复上述步骤7-8次通常可以完成粉砂的分馏。

现在，我们手头上有了3个级别的分馏样：细粉砂、粗粉砂和砂。每级样中取1-1.5g置于一个16×100mm的试管中。

现在，加入10%的盐酸以除掉碳酸盐。如果碳酸盐存在的话，将会观察到试管中的反应；然后，以每分钟500转（即500rpm）的速度离心样品3分钟，倒掉上部清液。这一步骤应该重复多次，直到加入盐酸后试管中无反应发生为止。用蒸馏水洗两次后，加入浓硝酸，并把试管至于沸水浴中，直到反应减弱至停止；这一步骤用于去除有机物，通常需要1小时时间。也可以采用30%的过氧化氢或者铬酸和硫酸的混合物。过氧化氢需要长得多的时间来除掉有机物，而铬硫酸不能够加热，因此，试管必须放置1天，以彻底去除有机物。

即使采用硝酸这种很强的氧化剂处理，许多样品中常常仍然保留有大量的有机物，从而阻碍了植硅石的浮选；而这一现象在氧化处理过程中察觉不到，因为在加入更多的浓硝酸后试管中并无反应。然而，我发现在这种情况下试管中的上部液体已变成红色或桔红色；这表明有机物仍然大量存在，并且将会妨碍植硅石的分离。把十分之几克的氯酸钾直接加入到含有土壤和硝酸的加热试管中就可解决以上问题。如果上部液体不再呈现红色，则表明有机物已被较充分地氧化，植硅石的成功提取就有可能了。

在去除碳酸盐和有机物以后，就可进行重液浮选了。植硅石的比重范围是1.5-2.3，而石英的比重是2.65。因此，重液溶液比重调解到2.3-2.4之间可以使植硅石浮在上面，而使土壤颗粒沉降到试管底部。有几种化合物和溶剂能够用于配制重液溶液，它们包括：碘化镉和碘化钾、四溴乙烷和无水乙醇、四溴乙烷和硝基苯、溴仿和硝基苯、以及溴化锌和水。我发现第一组合，即碘化镉和碘化钾效果很好。这一方法首先被Carbone (1977)采用。用它分离植硅石总是得到最清洁和最丰富的效果，而且它比其他含有有机溶剂溶液较优越，这是因为它不是致癌的，也不放出有毒气体；它溶于水，因此，可以避免采用酒精或其他试剂作为溶剂和洗涤剂。

加入10ml比重为2.3的碘化钾镉溶液（配制方法：把大约470g碘化镉和500g碘化钾加入到400ml水中）至土壤样品中。样品在每分钟1000转的速度下混合并离心5分钟。离心后，用巴斯德吸管小心地吸取悬浮在试管液体最顶层的植硅石，移置于另一个16×100mm的试管中，然后，样品重新又混合并离心几次，以从土壤中分离出大多数植硅石。

从样品中分离出植硅石后，按照2.5：1的比例把蒸馏水加入至含植硅石的试管中。这使它们的比重降低至1.5以下，从而使得植硅石沉降于试管底部。试管以2500rpm/min离心10分钟，倒掉上部清液。重复这一步骤2次，可以从植硅石中除掉重液。然后，用丙酮洗2次，以快速变干，并用Permount树胶固定制片。Permount树胶比加拿大冷杉胶便宜得多，并且有适合于观察植硅石的折射率。

植硅石的折射率是1.42左右，如果用折射率为1.51-1.54的固定剂来制片，则植硅石将呈现比固定介质明显大得多的起伏。植硅石的鉴定和统计可以采用岩石显微镜或者通用的光学显微镜。但采用岩石显微镜有几个优点，即在植硅石制备过程中掺入的外来非硅质物质能够很快地被发现，这对于刚开始植硅石分析工作并且对植硅石的许多形状不熟悉的人来说尤其有用。未做玻片的植硅石可以悬浮于无水乙醇，并储存在小瓶中待用。

泥炭和其他有机质含量高的沉积物中含有腐殖酸胶体，粘附于植硅石上，并改变其比重，从而在重液中难于悬浮。腐殖酸胶体在土壤中的存在有时可以通过加入重液后在试管顶部出现一种黄色物质而觉察到。可以采用10%的氢氧化钾溶液加热处理5-10分钟来去除腐殖酸胶体。这一步骤应该在重液浮选以前进行。即使在很强的碱性溶液中，这一短暂处理也不至于溶解植硅石。

至少0.1g重植物首先浸泡于1%的六偏磷酸钠（Alconox）溶液，置于16×100mm的试管中；几小时后，用蒸馏水洗几次。这种大小的试管可以按12个一批进行。0.1g样品通常足以得到大多数种的代表性植硅石标本。加入10ml舒尔兹溶液(Schulze solution)（由3份浓硝酸+1份饱和氯酸钾溶液配制而成）至试管中，然后置于沸水浴约1小时，经常搅动。

半小时后，如果植物材料未完全浸解，小心地向样品中直接加入少量固体氯酸钾，直到有机物完全溶解。若当加入氯酸钾后无任何反应，或者当所有植物都沉到试管底部的时候，可以认为反应已经完成。氧化过程不应超过1.5小时。如果是抗浸解的含蜡余液，可置于乙醇和苯的1：1溶液中。

植硅石余液用蒸馏水洗2次，用10%的盐酸洗1次以除去钙，又用蒸馏水洗2次，最后，用丙酮洗2次以快速弄干余液。可以用1500rpm的速度离心10分钟来完成以上步骤。弄干的植硅石用Permount胶固定到玻片上，或者悬浮于无水乙醇中，转移到小瓶储存。

替代药品：

浓硫酸放在80℃的热板上2-4小时，接着加入30%的双氧水，直到液体变得清洁、无色。

所需试剂：

5× TBE buffer 1000 mL: Tris 碱54 g，27.5 g硼酸，20 mL pH 8.0的0.5 mol/L EDTA。

40%丙烯酰胺贮存液:称取丙烯酰胺38 g，2g N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺，加蒸馏水至100 mL，室温避光保存。丙烯酰胺具强烈的神经毒性，可经皮肤吸收，称量时要戴手套和面具，一般聚合后的聚丙烯酰胺无毒，考虑到其中可能有少量没聚合的丙烯酰胺，仍需小心处理。

10%过硫酸铵:0.4 g过硫酸胺加4 mL蒸馏水，在4 ℃可保存数周。

6× 凝胶加样缓冲液: 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰，4℃保存。

TEMED(N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺): 液体，使丙烯酰胺单体聚合成长链。

固定/终止液:冰醋酸100 mL、蒸馏水900 mL。

染色液: 1L水中加入1 g AgNO₃ ，使用前10min加入37%甲醛2 mL，混合后即可使用。

显影液(使用前5h配制):1L蒸馏水中加入30g Na₂CO₃，冷却至4℃。使用前5 min加入37%甲醛2 mL、10 mg/mL Na₂S₂O₃ 200μL。